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應(yīng)如何正確溶解重組蛋白產(chǎn)品?

  • 發(fā)布日期:2021-01-25      瀏覽次數(shù):2483
    •   應(yīng)如何正確溶解重組蛋白產(chǎn)品?
        第1步:開蓋前離心試劑管。凍干粉在運(yùn)輸過程中可能會(huì)因顛簸而漂散并粘貼于管壁或管蓋上,所以在打開塑料瓶蓋前,需將凍干粉通過離心收集到管底,以便用很小體積的液體即可將凍干粉*溶解。一般需要3000-3500rpm離心5min,效果良好。
        第2步:用無菌水重懸至0.1-1.0 mg/ml,不可振蕩。這個(gè)步驟即為溶解步驟,非常重要。
        1) 一定要用推薦的溶液重懸(或溶解)凍干粉。蛋白的溶解性與很多因素有關(guān),其中比較重要的是pH值和離子強(qiáng)度。產(chǎn)品說明上所標(biāo)明的溶解液是能夠?qū)⒃摷?xì)胞因子或重組蛋白*溶解的液體。如果您所用的溶解液的pH值和離子強(qiáng)度與說明書中所標(biāo)明的不符,很多時(shí)候會(huì)造成細(xì)胞因子或重組蛋白不能*溶解或者根本無法溶解,這樣所配得的細(xì)胞因子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。
        2) 一定要溶解到的濃度。蛋白在一定的濃度范圍內(nèi)可以保持良好的穩(wěn)定性,這個(gè)范圍就是說明書上所標(biāo)明的濃度范圍,一般為0.1-1.0 mg/ml。但這一濃度范圍對(duì)于不同的重組蛋白是不同的。高于或低于該濃度范圍時(shí)細(xì)胞因子或蛋白會(huì)不穩(wěn)定,即很容易出現(xiàn)活性下降的現(xiàn)象。其次,高于這個(gè)濃度范圍,可能會(huì)超過該蛋白的大溶解濃度,即蛋白無法*溶解。再者,高于或低于該濃度范圍,蛋白可能會(huì)出現(xiàn)聚集(aggregation),終結(jié)果還是部分蛋白未溶解,導(dǎo)致蛋白活性的減弱。
        3) 一定不能振蕩(vortex)。這里所說的振蕩是指用渦旋儀進(jìn)行快速振蕩。請(qǐng)用放至室溫的緩沖液作為溶劑。加緩沖液后,蓋好瓶塞,輕輕用手翻轉(zhuǎn)瓶子或把瓶子放在一個(gè)緩慢搖擺的搖床上。這樣做來保證緩沖液能夠接觸到瓶子的整個(gè)內(nèi)壁。 讓瓶子在室溫放置至少10 - 15分鐘,然后可以進(jìn)行分裝或使用。
        第3步:該重懸液在2-8℃長可保存1周。
        用說明書上推薦的溶液將細(xì)胞因子或重組蛋白重懸到推薦的濃度后,細(xì)胞因子或重組蛋白可放置在2-8℃,即冰箱的冷藏室。在這種條件下,細(xì)胞因子或重組蛋白的活性長可保持1周。這對(duì)一個(gè)周期為5-7天的實(shí)驗(yàn),如DC(樹突狀細(xì)胞)的誘導(dǎo)成熟是足夠的。在此期間,只要每次從冰箱里吸取一定量的細(xì)胞因子或重組蛋白溶液加入到培養(yǎng)體系內(nèi)即可。
        其實(shí),說明書上推薦的濃度對(duì)于一般的實(shí)驗(yàn)來講是比較高的。所以用戶通常會(huì)將該溶液進(jìn)一步稀釋后再放在4℃保存,待1周內(nèi)用完。如進(jìn)行稀釋,必須遵照下面第4步的方法,即需用含載體蛋白的溶液進(jìn)行稀釋,否則稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白很容易會(huì)粘附在管壁或瓶壁上,使得溶液中的細(xì)胞因子或重組蛋白的濃度下降,細(xì)胞因子或重組蛋白的總活性則大為減弱。
        第4步:如要長期保存,則需用含載體蛋白(如0.1% BSA,或10% FBS,或5% HSA)的溶液進(jìn)一步稀釋,然后分裝凍存于-20℃至-80℃。
        如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期長于一周,或配制的細(xì)胞因子或重組蛋白一次用不完,我們就需對(duì)細(xì)胞因子或重組蛋白進(jìn)行長期保存。方法是:將已重懸的細(xì)胞因子或蛋白用含載體蛋白,如0.1% BSA(牛血清白蛋白),10% FBS(胎牛血清),5% HSA(人血清白蛋白)的溶液將重懸液進(jìn)一步稀釋,然后分裝凍存于-20℃至-80℃,即常規(guī)冰箱的冷凍室或超低溫冰箱中。
        在分裝凍存前,一定要用含載體蛋白的溶液將重懸液進(jìn)一步稀釋。稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白可為任意濃度,因大量的載體蛋白可以保證低濃度細(xì)胞因子或重組蛋白仍然維持較高的穩(wěn)定性。
        即在做無血清培養(yǎng)或動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí),細(xì)胞因子中不能含有BSA,F(xiàn)BS或HSA等動(dòng)物或人的蛋白,要想長期保存細(xì)胞因子或重組蛋白則可用海藻糖(Trehalose)作為載體,用含海藻糖的溶液來稀釋已重懸的細(xì)胞因子或重組蛋白,然后分裝凍存。

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