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想選擇合適的二抗就必須會(huì)這些常識(shí)!

  • 發(fā)布日期:2019-07-25      瀏覽次數(shù):3160
    •      想選擇合適的二抗就必須會(huì)這些常識(shí)!
          二抗是指用于靶向結(jié)合一抗的抗體。在多種免疫印跡、ELISA以及免疫熒光等免疫實(shí)驗(yàn)中,二抗經(jīng)常和一抗結(jié)合使用以檢測(cè)目標(biāo)蛋白。很多二抗都帶有標(biāo)記物,例如AlexaFluor熒光染料或辣根過氧化物酶(HRP),從而使二抗的信號(hào)可以被檢測(cè)到。
          實(shí)驗(yàn)中也可以使用帶有標(biāo)記物的一抗,但是二抗有很多優(yōu)點(diǎn)。無論是使用哪種一抗進(jìn)行檢測(cè),使用二抗可便于更換不同的標(biāo)記物。例如,同樣的一抗可以與HRP標(biāo)記二抗一起用于免疫印跡,也可以與另一種AlexaFluor488熒光標(biāo)記二抗一起用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)。
          另外,二抗結(jié)合在抗原位置的標(biāo)記染料比直標(biāo)一抗要多,從而增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)。使用二抗可以避免對(duì)一抗進(jìn)行復(fù)雜且昂貴的化學(xué)標(biāo)記(偶聯(lián)),而且偶聯(lián)反應(yīng)(具有氨基酸特異性)可能干擾一抗對(duì)抗原的識(shí)別。
          選擇合適的二抗
          要選擇出一種適用于您的應(yīng)用和研究的佳二抗,建議考慮以下因素:
          種屬來源和種屬反應(yīng)性;特異性反應(yīng);純化方法;交叉吸附;多重檢測(cè)能力;抗體類型和亞型;完整抗體還是抗體片段;標(biāo)記物;生物素結(jié)合蛋白。
          01    種屬來源和種屬反應(yīng)性
          種屬(Host)來源是指制備這種二抗的物種。常見種屬來源包括雞、驢、山羊、小鼠、兔、大鼠以及綿羊。因大多數(shù)一抗是在小鼠或兔的體內(nèi)制備的,山羊來源的抗鼠、抗兔IgG二抗是廣泛的商業(yè)化二抗。
          注意:所用二抗的種屬來源必須不同于一抗的種屬來源和反應(yīng)種屬。例如,如果一抗來源于兔,則不能使用來源于兔的二抗。
          02    特異性反應(yīng)
          區(qū)別于一抗的特異性概念(一抗只識(shí)別目標(biāo)蛋白),二抗的特異性指針對(duì)一抗的反應(yīng)特異性,其不僅包括特異識(shí)別目標(biāo)物種(一般經(jīng)交叉吸附),還包括特異識(shí)別目標(biāo)免疫球蛋白(Ig)的類型或亞型,以及該二抗是否和抗體的特定部分結(jié)合。
          常識(shí):如果一抗使用兔多抗,則需要使用抗兔二抗。如果一抗是鼠IgG2b,則二抗需特異識(shí)別該亞型。
          03    純化方法
          動(dòng)物血清或腹水一般經(jīng)四種常見純化方法:親和純化、特異性純化、層析法、脫鹽法。大多數(shù)Invitrogen二抗經(jīng)過親和純化(protein A或protein G),純化后抗體純度能達(dá)到95%以上。特異性純化是將抗原固定后進(jìn)行純化的方法,可以保證抗體純度和特異性更高,大多數(shù)Invitrogen流式應(yīng)用的二抗都經(jīng)過此方法純化。
          04    交叉吸附(Cross-Adsorbed)
          對(duì)二抗進(jìn)行交叉吸附可以幫助去除來源于非目標(biāo)抗體和蛋白的交叉反應(yīng)性,從而提高抗體的特異性。交叉吸附是指將親和純化的二抗通過一個(gè)固定有其它種屬來源的抗體或血清蛋白的純化柱。能夠識(shí)別這些其它種屬來源的抗體或血清蛋白的二抗將結(jié)合在純化柱上,通過這種方法可以獲得交叉反應(yīng)性更低的二抗,從而降低背景和提升抗體效價(jià)。

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